基于RT-PCR微流控芯片集成技术的多重检测系统，用于四种蜜蜂病毒的现场检测
2025-08-31 09:03:33 来源：麦姆斯咨询 评论：0 点击：
这种便携式双模式微流控检测系统，结合实验室检测与现场可视诊断，可用于四种蜜蜂病毒的现场检测。该检测套件不仅可以减轻疾病影响，还可以通过及时干预，提升养蜂业的经济可持续性，从而促进养蜂健康管理。
作为维持农业生态系统和生物多样性的关键物种，蜜蜂为全球三分之一依赖传粉媒介的作物提供传粉服务，而且，蜜蜂的产品在药物、食品工业等领域也具有巨大的经济价值。然而，近几十年来，蜂群崩溃综合征（CCD）在全球范围内的传播严重威胁了养蜂业的可持续性。在导致蜂群崩溃综合征的病原体中，四种病毒尤为突出：慢性蜜蜂麻痹病毒（CBPV）、畸形翅病毒（DWV）、以色列急性麻痹病毒（IAPV）和黑蜂王台病毒（BQCV）。这些单链RNA病毒通常表现出协同致病性，通过寄生螨或直接接触传播，加剧了蜂群损失。值得注意的是，它们的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）基因在病毒基因组中具有高度保守区，这既提供了诊断靶点，也提供了关于病毒潜伏和进化风险的洞察。
现有的诊断方法包括生物检测、免疫技术，例如免疫胶体金试纸和酶联免疫吸附测定，以及分子方法，包括定量RT-PCR、常规RT-PCR、等温核酸扩增和基因测序。然而，这些方法受限于对专业设备的需求、高操作成本、劳动密集的工作流程以及严格的专业技术知识。此外，这些方法无法支持在野外环境中进行快速现场检测，这严重限制了它们在蜜蜂病毒性麻痹疾病监测中的实用性。因此，迫切需要开发适用于现实世界养蜂应用的便携式、高灵敏、高特异性诊断解决方案。
微流控作为一门交叉学科的前沿技术，通过微尺度流体控制革新了诊断技术，将多步生化过程整合到紧凑的芯片平台上。凭借其广泛优势（小型化、自动化和成本效益），已在医学诊断、环境监测和食品安全等领域得到验证。
据麦姆斯咨询报道，借助上述进步，锦州医科大学的研究人员开发了一种便携式双模式微流控检测系统，结合实验室检测与现场可视诊断，可用于四种蜜蜂病毒的现场检测。该检测套件不仅可以减轻疾病影响，还可以通过及时干预，提升养蜂业的经济可持续性，从而促进养蜂健康管理。该研究成果已经以“Construction of a portable multiplex detection system for four bee viral paralysis diseases based on RT-PCR-microfluidic chip integrated technology”为题发表于BMC Veterinary Research期刊。
集成RT-PCR-LFD-MFCT检测系统
本研究通过整合RT-PCR扩增、免疫胶体金试纸（LFD）和微流控芯片技术（MFCT），成功构建了一种可视化快速检测平台（图1）。该检测方法的核心在于设计了一种双标记引物系统：正向引物在其5'端用地高辛（DIG）修饰，反向引物在其5'端用羧基荧光素（FAM）修饰。目标核酸在芯片的微反应腔内进行扩增，DIG-和FAM标记的引物特异性地结合到扩增产物的两端。扩增完成后，产物通过毛细作用迁移到试纸的检测区。在偶联垫处，胶体金标记的抗FAM抗体被释放并与扩增产物上的FAM标记结合形成复合物。该复合物继续横向迁移到测试线（T线）。在T线上，抗DIG抗体被固定。当复合物流经该区域时，扩增产物另一端的DIG标记被T线上的抗DIG抗体捕获。这形成了“固定抗DIG抗体-DIG标记-核酸扩增产物-FAM标记-胶体金标记抗FAM抗体”的双抗体夹心复合物，产生可见的红色条带，便于直接进行判读。
图1 检测系统示意图
RT-PCR-LFD-MFCT灵敏度
标准质粒跨越三个对数梯度进行10倍连续稀释，并使用检测条在优化条件下进行测试（图2A-D）。当使用1:1正反向引物比例和0.6 µL引物体积时，未观察到假阳性结果，确定该方法检测限（LOD）为10² copies/µL。
图2 RT-PCR-LFD-MFCT灵敏度评估
RT-PCR-LFD-MFCT特异性
在最佳实验条件下，验证了RT-PCR-LFD-MFCT检测对四种蜜蜂病毒（图3A-D）的特异性。结果表明，该方法仅对CBPV、BQCV、DWV和IAPV模板进行特异性扩增，未观察到对非靶病毒的非特异性反应。这些结果与常规RT-PCR结果一致，证实了所开发方法的高特异性。
图3 RT-PCR-LFD-MFCT特异性验证
本研究成功开发了一种用于检测四种蜜蜂病毒性麻痹病原体（CBPV、BQCV、DWV和IAPV）的RT-PCR微流控芯片集成方法。RNA提取和cDNA合成使用商业试剂盒进行。制备好的样品随后加载到微流控芯片中，通过便携式微流控PCR系统进行扩增，最终使用便携式密封胶体金基侧向层析法试纸条进行结果可视化。该方法可在5分钟内获得可见比色结果，结果有效期为10分钟，并且无需专业设备即可同时鉴定所有四种病毒。
图4 利用RT-PCR-LFD-MFCT系统对12个模拟临床样本进行随机检测
本研究提出的方法虽然能产生多重信号，但与传统多重检测技术有所不同。通过系统内的特定设计，该方法实现了对单个病毒的独立检测。该方法不仅提高了检测效率，还避免了交叉反应，从而确保了检测结果准确可靠。其次，RNA采用常规试剂盒提取，随后合成cDNA。然而，目前已有无需设备的快速RNA提取方法。研究人员正在探索将这两种方法结合，以增强整个检测系统的便携性。
总之，本研究开发的基于RT-PCR的侧向层析试纸条（LFD）和微流控芯片技术（MFCT）检测平台具有高灵敏度、高特异性、快速性和便携性，为蜜蜂麻痹病的精准诊断和管理提供了有力工具。然而，仍需进一步改进以增强抗环境干扰性、降低消耗品成本、优化用户友好性，并应对病毒多样性和进化的挑战。未来工作应着重于完善样品预处理方案、推进检测套件材料工程，并通过蜜蜂病毒监测网络促进跨学科合作，以确保为可持续养蜂提供有力支持。
论文链接：https://doi.org/10.1186/s12917-025-04969-5
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