新型电光采样法突破红外吸收光谱分析的灵敏度局限
2020-01-04 09:02:52 来源:麦姆斯咨询 评论:0 点击:
红外光谱对光透过率的依赖限制了其在许多分析应用的灵敏度。现在,一种利用从分子发射红外辐射的方法有望解决该问题。
据麦姆斯咨询介绍,用红外光照射分子时,分子中的化学键或官能团可发生振动吸收,不同的化学键或官能团吸收频率不同,在红外光谱上将处于不同位置,从而可获得分子中含有何种化学键或官能团的信息。因此,样品的红外吸收光谱可用作表征其化学成分的分子指纹。红外光谱成为一种被广泛应用的分析技术。但是,当需要测量低浓度的分析物和水中的样品时,红外光谱分析法就捉襟见肘了。德国路德维希马克西米利安大学的Pupeza等人在《自然》(Nature)上发表的文章中,提出了一种有望突破上述红外光谱应用限制的方法。
红外光是William Herschel在对太阳进行天文观测时发现的——红外光在他的眼中产生了令人困扰的发热,希望将其过滤掉。发展到今日,人们已经认识到红外辐射可用于多种物质成分分析的优点。红外光谱分析的应用范围从探测外太空分子(包括火星上的水分子),到破译生物体的蛋白质分子机制。在日常生活中,红外光谱分析可用于食品分析、法医鉴定。因为生物组织和体液分析可用于检测和诊断疾病,许多红外光谱研究正在用于医疗领域。
对生物样品进行红外光谱分析的主要问题之一是水对红外辐射的强烈吸收,大多数情况下样品厚度被限制在10微米以下。带来的另一个问题是难以向样品中添加试剂(例如酸或碱)来控制样品的分子状态。这种操作对于研究小分子与蛋白质的结合是合乎常理的,对紫外光谱法或可见光谱法来讲也是一种标准操作。但是,由于红外辐射会被水吸收,往往样品必须经过浓缩或干燥。
Pupeza及同事提供了解决方案。他们用超短脉冲(飞秒级,1飞秒为10⁻¹⁵秒)的中红外光照射样品。特定频率的光被样品分子吸收,产生振动,并在脉冲结束后继续,直到振动能量消散到环境中为止(这需要几皮秒,1皮秒为10⁻¹²秒)。因为振动原子带有电荷,因此会产生电磁辐射,类似于振荡电子在天线中产生电磁辐射的方式。所产生的辐射与分子振动频率相同,因此携带有关所有样品分子的信息,作者称其为“全局分子指纹”(global molecular fingerprint)。近红外光谱范围内,通过被称为“电光采样”的新方法,利用一束二次超短光脉冲来测量分子信息。
从概念上讲,Pupeza等人采用的方法不同于常规吸收测量。在吸收光谱法中,信号只能从与样品不发生相互作用的光间接感应到(如下图a)。因此,轻微改变透射光的强度,就很难检测到弱吸收。从理论上讲,可以通过增加入射光的强度来改善对弱吸收体的检测,但是通常使用的红外探测器在遇到较高光强时灵敏度降低,实际上限制了可用的最大光强。相比之下,Pupeza等人直接从振动分子发出的辐射检测到目标信号(见下图b)。这与可见光谱范围内的吸光光谱测量和荧光光谱测量的差异类似:荧光光谱测量更为灵敏,因为可以直接从样品中检测信号,甚至可以从单个分子中检测到信号。
图1:获取红外光谱的新方法。a:传统的红外光谱分析中,分子被红外光照射。它们吸收某些频率的光,从而引起振动。目标信号是透射光谱中的吸收“波谷”,但是当样品被高度稀释时,透射光的整体强度只有小幅改变,从而限制了该技术的灵敏度。b:Pupeza等人用超短脉冲红外光照射分析样品,引起样品的分子振动。这些振动在脉冲结束后继续,并产生红外辐射,在此显示为在脉冲拖尾的“尾巴”。分析该“尾巴”以确定分子的红外光谱。由于实验信号是发光的并且可以直接检测到,因此该方法比吸收红外光谱法更灵敏。
Pupeza及其同事以各种方式展示了他们这种方法的高灵敏度。例如,与使用吸收光谱法相比,他们能够检测出浓度低40倍的溶液中的化合物,并能更好地区分两种相似的化合物。他们还获得了能阻挡几乎所有入射光的生物样品的光谱(某些情况下,至少为99.999%)。现有方法只能看到黑暗,但新方法却能感知光线。这是令人印象深刻的成就,传统红外光谱分析的两个主要问题:灵敏度不够高、对水的强红外吸收,都可以得到改善。无需样品浓缩或干燥,这种方法在许多情况下能简化样品制备。
作者还提出了一些推广该方法的想法,例如提高照射样品的激光功率。目前的方法无法实现水中单分子检测灵敏度的最终目标,希望这些想法将进一步缩小技术差距。其它挑战将是增加测量的光谱范围到更短的波长,在该波长处发现蛋白质、脂质和核苷酸的具有诊断意义的有效信号,并开发出价格具有竞争力、有商业化前景的光谱仪。
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