利用创新微流控技术纯化基因组DNA，促进长读长测序的广泛应用
2025-02-10 20:59:27   来源：麦姆斯咨询   评论：0   点击：

凭借减少样本量，以及将样本制备和分析整合到一个完全自动化设备中的优势，微流控处理和分析DNA仍然是一个充满前景且活跃的研发领域。细胞裂解液中包含许多污染物，在进行DNA分析之前必须去除。这些污染物包括生物样本原生的成分，例如植物样本中的多糖，或裂解过程中使用的试剂，例如盐和洗涤剂等。在实践中，通常使用液相或固相萃取方法（包括可逆结合DNA的磁珠）对相对较大量的样本（毫升级）进行纯化。然而，这些方法耗时耗力，涉及多个移液管转移和离心步骤。离心破碎单个DNA链所产生的应力，在制备长读长测序样品时是希望避免的。

DNA纯化应用的微流控技术通常致力于将宏观技术微型化，例如凝胶电泳和固相吸附等。大多数微流控纯化方法（包括流式分级分离、电动捕集和等速电泳等），依赖于核酸和污染物（例如蛋白质）之间的流动特性差异。然而，实现并维持有效分离所需要的浓度梯度与商业化洗涤试剂盒的纯度水平相当，仍具有挑战性。由于稀释提取物和蛋白质污染等固有挑战，微流控方法尚未被广泛采用。磁珠尽管成本较高，并且在许多情况下只能一次性使用，其应用却日益普及，反映了寻求替代方法获得高纯度样品仍然存在困难。

据麦姆斯咨询报道，美国弗罗里达大学（University of Florida）的研究人员开发了一种完全不同的分离机制，基于在轴向电场和流动作用下长聚电解质分子的横向迁移，提供了相比现有方法更有效的分离，有望对DNA研究乃至最终的患者治疗带来积极影响。

微流控技术可将复杂的实验室过程（例如混合、反应、分离等）微型化到只有显微镜载玻片大小的装置中。弗罗里达大学研究团队开发出的用于DNA纯化的微流控器件，可以加快实验室样本的分析速度，并达到或超过现有方法获得的纯度。

DNA电流体动力学分离（EHS）器件及设计。（A）微流控器件的比例图，展示了四个关键区域：入口、陷阱、分离通道、出口；（B）通道内分离机制示意图；（C）实验装置示意图。

该研究成果已经以“Microfluidic Purification of Genomic DNA”为题发表在National Academy of Sciences上。在论文中，弗罗里达大学教授Jason Butler博士、Tony Ladd博士以及四年级博士生兼研究助理Jiayi Wang详细介绍了他们开发的新型微流控器件，该器件无需离心机、磁珠或凝胶就能提取基因组DNA。

纯化去除DNA样本中的杂质，可确保遗传物质的完整性，提供更准确的实验结果。要纯化DNA，必须打开单个细胞，去除蛋白质及其他杂质，然后回收纯化的DNA。

目前的纯化方案通常会将DNA分子破碎成小片段。Butler认为，他们的微流控方案更温和，能有效减少DNA碎片化。

他们开发的微流控器件只有显微镜载玻片大小，利用流体流动和电场推动包含污染物的DNA溶液通过一个约100微米见方的通道，大约相当于人类头发丝的大小。流体流动将盘绕的DNA扭曲成细长形状，使电场能够将它们推向通道壁。

利用荧光成像来测量陷阱区域内的原位DNA浓度，显示了不同流速和电场强度下浓度最高区域（靠近分离通道入口）的图像。分离通道入口附近的DNA截留量取决于分离通道中的剪切速率和电场，最大捕获发生在最高场强处（AH = 10 mm，V = 400 V）。

弱剪切与轴向电场的耦合，对于柔性长带电分子具有高度的选择性，而在典型细胞裂解物中只有DNA满足要求。随着被推向通道壁，DNA通过电泳被保持在通道入口附近（通道壁附近没有流动），而其余成分则被更大（至少10倍）的对流流体洗脱。通过在不到30分钟的时间内从10 pL大肠杆菌裂解液中回收高达40 ng的纯化DNA，研究人员证明了该微流控器件的可行性。提取的样品通过PCR显示出强扩增，而原始裂解物则没有。研究人员使用A-DNA和BSA的混合物来确定DNA与蛋白质（30 mg/mL）的分离程度，结果显示，提取物中的蛋白质浓度（0.3～0.5 ng/uL）比初始混合物降低了五个数量级。

Butler说：“DNA移动到通道壁上并积聚，样品中的所有其他成分则被流体带走。”

“DNA测序可用于确定癌症等疾病。”Butler解释说，“长读长测序可以识别基因组中难以通过短序列识别、但被怀疑与癌症有关的基因组区域。”

鉴于样本制备的便捷性，这种微流控纯化技术有望促进长读长测序技术的更广泛应用。这种测序仪可以对长链DNA进行测序，而不会将其分解成更小的片段。

总结而言，提取纯化是遗传分析必不可少的先决条件，下一代测序技术对样品的纯度和完整性提出了越来越高的要求。这项研究展示了一种用于从细胞裂解物中提取纯化DNA的微流控技术。耦合剪切和电场驱动长聚电解质分子（例如DNA和RNA）在电场线上迁移，实现高选择性的分离，去除蛋白质、盐和细胞碎片。该微流控器件的独特之处在于利用DNA的灵活性将其与污染物分离。凭借简单的设计，就能达到与磁珠提取试剂盒相当的样品纯度。加上由节省材料带来的低成本，使其对于即时诊断应用极具吸引力。

论文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2417757122

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