综述：用于细菌检测的纸基传感器
2023-02-18 21:22:06   来源：麦姆斯咨询   评论：0   点击：

病原菌的检测对于预防和治疗感染以及保障食品安全至关重要。目前的金标准检测技术，例如培养基检测和聚合酶链反应（PCR），不仅耗时，并且还需要集中在实验室进行。因此，人们致力于开发快速、廉价、便携且不需要专门培训的即时检测（POC）装置。基于纸张的分析装置恰好满足上述标准，特别适合在资源匮乏的环境中部署。

据麦姆斯咨询报道，近日，新南威尔士大学（The University of New South Wales，UNS）化学工程学院和澳大利亚纳米医学中心（Australian Centre for Nanomedicine，ACN）的研究人员在Nature Reviews Bioengineering期刊上发表了一篇题为“Paper-based sensors for bacteria detection”的综述文章，他们讨论了纸基细菌检测平台，不包括如病毒、寄生虫和真菌等其它微生物病原体。重要的是，目前，只有满足（或接近满足）以下标准的健康诊断、食品质量控制和环境监测领域的研究被包含在内：传感器可以评估未经处理或未加工的样品，在资源匮乏的环境中满足可现场部署即时检测的REASSURED标准，并在相关实际范围内达到检测限（LOD）。对于后一个标准，重点将放在实现小于10²菌落形成单位（CFU） /ml的低检测限。同时，研究人员总结了纸基细菌检测平台面临的主要挑战。

注：REASSURED是Real-time connectivity, Ease of specimen collection, Affordable, Sensitive, Specific, User-friendly, Rapid/Robust, Equipment-free and Deliverable首字母缩写。

纸基传感技术发展时间线

纸基传感平台

纸基传感器的一个重要特点是，其可以通过毛细管流动自发地输送液体，因此不需要泵。此外，纸基传感器易于调节纸张孔径，以改变流速，并且纸张具有高的表面积与体积比，可使试剂固定和储存。最受欢迎的纸基传感平台是基于比色法的横向流动分析（LFA）。通常，横向流动分析由样品垫、共轭垫、检测垫和吸收垫等组成。

商用纸基传感器

针对标准的夹心免疫测定，首先需将样品引入样品垫以启动吸收过程。然后样品移向共轭垫，与标记的检测生物受体（通常是纳米粒子偶连的抗体）相互作用。在进一步迁移后，样品到达检测垫，检测垫包含一条测试线（捕获的生物受体与标记的分析物结合），以及一条对照线。最后，吸收垫吸收多余的样品，并规定测试所需的样品体积。纸基微流控分析装置遵循类似的机制，并受益于简单的设计、低廉的成本和5~30分钟的快速响应时间，具体取决于样品特性和应用场景。相比之下，尽管敏感性相当，基于电化学的技术研究却有所下降，可能由于其成本较高。

研究人员注意到，不同的应用需要不同的采样方法（破坏性或非破坏性）、质量保证和行业标准。例如，在固态食物样品中，病原体不像在液态样品中分布的那样均匀。本文中，研究人员将严格满足使用未加工样品、即时检测适用性和证明相关检测限标准的研究，根据样品的固体、液体和气体状态对其进行分组。该应用将从临床诊断到食品和环境中的病原体检测。

纸基传感器的操作过程

固态样品

用于固态样品（如牛肉、海鲜、面包和生菜）中细菌检测的纸基传感平台大多是基于比色的横向流动分析。这些传感器对用户很友好，适用于资源匮乏环境中的即时检测应用。研究人员基于横向流动分析结合扩增技术设计了几种平台，例如用于细菌检测的聚合酶链反应、表面增强拉曼光谱（SERS）或免疫磁性分离（IMS）等平台。他们还开发了使用环介导等温扩增（LAMP）或纸基酶联免疫吸附试验（ELISA）的其它方法。然而，此类方法需要加热，并且需集中在实验室处理，同时需要多个处理步骤，尽管该类系统更加复杂，但其灵敏度并不比简单的替代方案低多少（10²~10⁴菌落形成单位/ml）。虽然CRISPR-Cas纸基细菌检测分析受益于固态样品的低检测限（1~10²菌落形成单位/ml），但它们需要重组酶聚合酶扩增（RPA）或重组酶辅助扩增（RAA）方法。这些步骤需在37°C~42°C间进行，与环介导等温扩增的60°C相比，更接近室温，然而，仍需要电源。此外，扩增组分（如Cas蛋白和引物）需要储存在远低于冰点的温度（零下20 °C）下，这意味着基于环介导等温扩增和基于CRISPR的方法在其当前状态下，并不符合所有的REASURED标准。

液态样品

与固态样品类似，针对液态样品（如血清、牛奶、水、果汁和婴儿配方奶粉溶液）中的细菌，研究人员主要使用基于横向流动分析的比色法检测，因其简单易行。其中大多数分析依赖于金纳米颗粒作为信号探针，但它们受到高检测限的限制（大于10³菌落形成单位/ml ），或需要样品预处理的限制。为了提高其性能，基于横向流动的分析已与磁性纳米颗粒等扩增方法相结合，以实现目标分析物（例如显色物质和酶）预浓缩，或实施聚合酶链反应、环介导等温扩增以及基于CRISPR-Cas的方法。然而，这些方法都受到以下一个或多个因素限制，例如高温、长响应时间、低灵敏度、大量样品制备和扩增步骤等。

气态样品

在空气悬浮液中也可以发现细菌，将其称为生物气溶胶。由于样品的性质，分析通常包括两个主要步骤：收集和检测。收集可通过沉淀、过滤、离心、冲击、撞击或微流控芯片实现。例如，带有细菌的空气样品可以通过纸基装置上的多孔采样垫。然后在取样垫上使用干燥的裂解缓冲液裂解收集到的细菌，释放DNA分子，然后通过水介导的侧向流将其输送至结合垫。这种测定的一个限制是，需要使用实时定量聚合酶链反应分析得到的等分试样。

总而言之，纸基分析平台的简单性和低成本引发了大量关于细菌检测的研究。与电化学、荧光或化学发光方法相比，大部分此类装置使用比色法作为分析技术。这种基于纸张的诊断工具在即时检测应用方面具有巨大潜力，但为了满足REASSURED标准，仍有几个关键挑战需要解决。特别是，考虑到特定的细菌和应用，需要改进检测限。选择性可以通过对样品中经常存在的目标化合物的干扰实验来解决，例如，对于临床诊断，应使用微生物群落背景和血清蛋白作为对照。在食品样品中，氨基酸、蛋白质和脂肪酸会干扰测定，而在农业样品中，土壤和植物蛋白质会影响测定。

此外，大多数研究通常评估其平台对其它致病菌的选择性。评估属或菌株水平的选择性以减少假阳性结果也很重要。细菌对环境或物理压力的反应会导致其表型状态或代谢活性的变化。因此，未来的研究，特别是那些依赖代谢释放的副产物（如挥发性有机化合物（VOC）和抗微生物菌株）的研究，必须定期校准，以明确这些变化，避免检测错误。此外，为了确保测量的准确性，需要考虑蛋白质水平、粘度和pH值。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s44222-023-00024-w

延伸阅读：

《即时诊断应用的生物传感器技术及市场-2022版》