微流控平台上的单细胞捕捉
2015-06-02 20:38:44   来源：微迷   评论：0   点击：

在单细胞研究领域，利用微流控系统分离单细胞，并作为反应容器制备单细胞NGS文库的方法近年来得到了越来越多的关注。其实，早在二代测序技术普及之前，就已经有不少用微流控装置分离单细胞的尝试了。如今，有代表性的策略可区分为微滴式流控和芯片式微流控。这两种策略采用的装置有很大差异，但它们的共性是将细胞分离到纳升（nL）级的微小容器中，以此提高单细胞制备效率，同时降低反应成本。

微滴式流控

微滴式流控装置的代表是由ddPCR （droplet digital PCR）制备器衍生出来的单细胞分离及反应设备。其工作原理是让悬浮的单细胞依其次通过一个超声装置，利用声波将含有细胞的水相液体连续分离为单独的微小液滴，并用表面活性剂处理以防液滴融合，最终收集到油相载液中统一反应。由于继承了ddPCR的高通量特性，此法可以批量制备上百万的液滴。以此为基础，并联两个相同的装置可以使不同液滴两两融合，可在反应过程中逐级添加试剂。此外，还可在制备流程中加入光筛，以流式细胞仪的原理自动剔除不含细胞的液滴，并富集具有共同表达特征的细胞。

由于微滴式流控系统有以上优点，已有公司正在尝试将其用于单细胞测序文库的制备，如RainDance。但是，在商业化的道路上仍有一些困难需要克服。首先，ddPCR反应设备适用于一步式反应，比如PCR。以单细胞RNA-Seq文库的制备为例，其反应流程包括裂解－逆转录－扩增三步，每步都需要加入新试剂以改变反应体系。但用表面活性剂处理过的液滴再融合的效率不高。其次，各个步骤的反应体系互相干扰，而现今还没有低损纯化单细胞级微量核酸的良策，我们就只能通过大幅稀释前一反应体系来保证下一步的效率。这样一来，每个步骤都会使得液滴体积增加，这可能对液滴的制备和形态维持带来一定困难。最后，现有设备很难精确控制液滴体积，样本间偏差可高达30－40％，导致反应效率不均，可能会最终影响数据的解读。

芯片式微流控

相较前者，芯片式微流控的相关技术已经成熟，相关文献不胜枚举，也有一批公司正在进行商业化尝试。集成化芯片在满足实验通量需求、降低单位反应成本的同时，还能够利用细胞的物理（声、光、电、体积等）或生物学性质（抗原）实现分选。此外，使用光刻模具制造出来的反应室可以达到很高的精度，消除了微滴式流控系统中反应容器体积不均一带来的弊端。

基于PDMS的芯片

在单细胞研究领域，近年来最吸睛的设备要数Fluidigm公司的C1 Single-Cell Auto Prep System。这也是目前唯一的实现了单细胞分离和NGS文库扩增一体化的商业产品。C1芯片的核心是通过叠加三层带有微液流通路的PDMS层来形成两套互相隔绝的体系，即流控通路和反应通路。反应通路为每个细胞预制了一系列反应室，以用于不同的反应阶段。流控通路则利用增压和释放压力来控制各个反应室之间的隔离与联通。在操作过程中，悬浮细胞依次流过与细胞大小大致匹配的捕获单元，以接近随机的方式”嵌入”滞留点，多余的细胞则被液流带出芯片。一块C1芯片最多可以捕捉96个单细胞。随后，每个细胞在各自独立的反应室中依次完成裂解－反转录－扩增（以RNA-Seq为例）的步骤。最终各个细胞的产物进入单独的存贮孔，方便使用者用常规移液枪转移到出来进行文库修饰。

PDMS具有透光性好，自发荧光低，生物相容性高，以及可塑性强等特性，因此被广泛应用于制造微流控装置。尽管制作微流控装置的技术门槛并不高（某些大学实验课就开设有相关内容），对于大多数专注于生物探索的实验室来说，投入资源去专门研究一套适用于单细胞研究的技术并不现实。C1的意义在于它为传统生物实验室提供了”平民化”的单细胞研究平台，使操作步骤”傻瓜化”，同时初步满足了通量和成本控制的要求。而之前的相关研究涉及到的设备通常需要实验人员有一定的技术积累，且高昂的下游实验成本和无法预测的结果让不少人止步于构想。C1的面世在学术界引领了一波单细胞研究的热潮，而这又活跃了更多人的思路，形成了良性循环。在C1面市以来的短短两年内，利用它作出的高水准学术论文已屡见不鲜，足见单细胞研究的魅力。

作为第一款基于PDMS的单细胞芯片系统，C1在学界引发了不小的反响，但它并非一把打开单细胞世界之门的万能钥匙。聚光灯带来的既有关注，也有挑剔的目光。总体来说，C1之后的平台还需要在以下三个主要方面做的更好：

更高的通量。单细胞研究需要观察足够数量的细胞，以确保少量样品的总体特征不偏离多细胞本体的原貌。C1的使用者之一，MIT的Alex Shalek于2014年发表在Nature上的文章中称，在他的研究中，大约30个细胞的测序数据整合起来才能大致与群体对照的结果吻合。Ehud Shapiro于2013年发表的一篇Nature综述中则提到需要至少50个细胞。 对单细胞个数的要求与实验对象的异质程度密切相关，因此我们不可能得到一个放之四海而皆准的数目。但是，不少于前面提到的数量，而且宁多勿少，是克服这一困难的共识。现在一个简单的实验就可能产生多个样品，或者突破的关键在于仅1％的细胞，面对这样的需求，C1的芯片最多只能处理96个单细胞，而且一个工作日只能完成一次实验（一个芯片）的设计不得不说是个瓶颈。面对这一挑战，固定细胞样品留待日后处理是一个解决的办法。但Fluidigm公司迟迟没有发布相关的操作指南，这是个遗憾。

更高的捕获效率。C1芯片采用被动的细胞捕获方式，每个随液流经过捕捉位点的细胞以一定几率被截留。据C1的产品手册提供的数据推算，用户需准备至少六倍于捕捉位点数目的细胞并达到一定的浓度才可能取得理想的结果。在此之前，样品细胞还可能需要经过离心浓缩，并分出一部分来用于计数。因此，这种高损比的方式对处理微量样品还不够理想。

更简便的捕捉验证方式。C1相较于流式细胞仪的一大优点是用户可以准确地探知每个位点是否成功地捕捉到了单细胞，同时还能用荧光染色确认细胞的活力。这样可以在不合要求的对象上节省一些成本。为了达到这个目的，C1采用的是在显微镜下逐个观察，人工排除的方式。这种低效的方式无疑会增长实验时间，引入人为误差，也在客观上构成了C1芯片不能大幅提高通量的原因之一。

尽管有以上缺憾，C1仍然是一款优秀的自动化单细胞处理设备。它集单细胞的收集、处理和文库扩增于一体的工作方式目前还没有同类产品能与之竞争，简化的工作流程使得一般实验室人员经过简单培训就能很容易地掌握其操作，而且微流控使得实验费用变得相对低廉，这些都成为了推动热门课题的进展的因素。另一方面，使用过C1的人可能都有体会，其芯片设计预留了相当的冗余。Fluidigm的CEO在一个访谈中曾做过一个类比，一块C1的芯片所包含的管道和阀门的数量大致和一家有一千个房间的酒店相当。如此复杂的设计使得C1的芯片可以用于更多的目的。所以，这款设备应当还有不少潜力。最近，Fluidigm以付费的形式开放了C1芯片的编程，允许用户自行开发新的应用。这无疑将刺激更多的人参与到单细胞研究中，加速产品的完善。